Leptospirosis adalah infeksi zoonosis yang signifikan secara global namun sering diabaikan. Disebabkan oleh bakteri patogen dari genus Spirochaeta Leptospira, penyakit ini terutama berada pada tikus dan mamalia kecil yang berfungsi sebagai reservoir utamanya. Pasuruan, sebuah wilayah yang terletak di provinsi Jawa Timur, Indonesia, telah diakui sebagai daerah enzootic infeksi wabah. Namun, adanya penyakit bawaan hewan pengerat lainnya belum dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi keberadaan Leptospira patogen pada tikus dan mamalia kecil di daerah wabah enzootic Pasuruan di Indonesia. Penelitian ini termasuk jenis penelitian analitik observasional dengan desain penelitian cross-sectional. Simple random sampling dilakukan untuk menjebak total 119 ekor tikus dan 12 mamalia kecil ginjal yang dianalisis secara molekuler (PCR) untuk mendeteksi bakteri Leptospira dengan gen LipL32 sebagai targetnya. Penelitian mengungkapkan bahwa 7,6% (9/119) tikus di daerah enzootic wabah (Sedaeng, Tosari, Surorowo, Petren, Pakis Bincil, Kutukan) ditemukan membawa DNA Leptospira, menunjukkan perbedaan yang signifikan antara tingkat infeksi per wilayah (p < 0,0001). Rattus tanezumi diidentifikasi sebagai reservoir leptospirosis di habitat pemukiman dengan persentase 13,2%, Rattus tiomanicus terdeteksi sebesar 28,6% di habitat hutan, dan Rattus exulans ditemukan sebesar 4,4% di kedua habitat. Temuan dalam penelitian kami, sangat penting bagi masyarakat untuk meningkatkan kesadaran penyebaran penyakit bawaan hewan pengerat, termasuk leptospirosis.